多花黄精皂甙的分离纯化工艺资料.docx

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多花黄精皂甙的分离纯化工艺资料

多花黄精皂甙的分离纯化工艺

皂甙是天然植物中具有重要生物活性成分之一。

据统计，有一半以上天然植物中含有皂甙。

国内外对于皂甙的生物活性已有很多报道：

如大豆皂甙、茶花皂甙可降血脂（Yoshikawa，2005）；轮叶党参的皂甙组分可以提高机体的免疫力（Byeon，2009）；昆诺阿藜皂甙（Kuljanabhagavad，2009）可作为疫苗添加剂。

Wang等（2001）和Cai等（2002）从湖北黄精的根茎中分离到一种薯蓣皂苷（dioscin）和一种薯蓣皂苷元（methylprotodioscin），体外实验表明具有抗癌作用，可见皂甙具有重要而广泛的生物活性或功能。

然而到目前为止关于黄精皂甙提取的工艺还鲜见报道。

而纵观一些关于植物皂甙提取的方法报道中，发现绝大多数的实验材料均购自药房，这样的材料大多已经处理或炮制，不能真正反映该植物体原有的特点或生物活性物质的含量。

为探讨和揭示黄精中的主要活性成分、提取方法或工艺，本研究直接从九华山挖掘黄精，对其中的主要活性物质黄精皂甙和多糖进行了连续分离提纯，摸索出一套经过优化的提取工艺，以期为开发我省黄精资源提供重要的理论基础。

1材料与方法

1.1原料及设备

1.1.1原料

黄精地下块茎原材料于2008年8月采于安徽省九华山，经本院周守标教授鉴定为多花黄精（PolygonatumcyrtonemaHua.）。

将采集来的新鲜黄精洗净，蒸馏水淋洗，晒干。

使用前将黄精粉碎，过60目筛，备用。

图1多花黄精（PolygonatumcyrtonemaHua.）植株（左）以及其块茎（右）

Fig.1Theplant（left）andthetuber（right）ofPolygonatumcyrtonemaHua.

1.1.2试剂

人参皂甙RB1标准品（GINSENOSIDE-RB1STANDARD）≥99%，型号/货号:

079-02191，购于上海贝基生物科技有限公司，产地为日本（说明：

目前市场上尚没有纯化的黄精皂甙标准品出售，故以人参皂甙标准品替代）；XAD-4型大孔树脂、XAD-1180型大孔树脂购于北京慧德易科技有限公司；无水乙醇、乙醚、浓硫酸、正丁醇、香草醛、冰醋酸、甲醇、高氯酸等试剂均为分析纯。

1.1.3仪器设备

超声波清洗器（KQ2100E，昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发器（RE-52，上海青蒲沪西仪器厂）；大容量离心机（800B，上海安亭科学仪器厂）；层析柱、HL-2恒流泵（上海精密科学仪器有限公司）；BSZ-100自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂）、数显恒温水浴锅（HH-4，金坛市杰瑞尔电器有限公司）、电子天平（FA-N/JA-N型，上海民侨精密科学仪器有限公司）、植物粉碎机（DYF-300型,温岭市林大机械有限公司）、干燥箱（DGX-9143BC-1，上海福玛实验设备有限公司）、721分光光度计（上海精密科学仪表有限公司）。

1.2皂甙提取

1.2.1皂甙提取的一般流程

黄精粉末

乙醇浸泡

超声波提取，浓缩

乙醚脱脂，得粗皂甙

1.2.2皂甙的提取

准确称取黄精粉末30g若干份，放入具塞圆底烧瓶，加入适量提取剂，按各种条件（料液比、时间、乙醇浓度、提取次数）进行超声提取（50℃,频率为28kHz），然后抽滤，滤渣再按上法重新提取。

1.2.3脱脂

乙醇超声提取得到的是含有脂肪的粗皂甙，采用乙醚萃取脱去粗皂甙的脂肪。

将乙醚和粗皂甙提取液以一定的比例混合置于分液漏斗中，摇晃分液漏斗使乙醚与提取液混合均匀，然后放气，静置一段时间，待有明显分层后弃去下层脂肪。

重复几次，直至乙醚与提取液无分层现象。

1.2.4皂甙的纯化

1.2.4.1水饱和正丁醇萃取纯化

配制水饱和正丁醇。

蒸馏水21ml，饱和正丁醇100ml（胡春风，2008）。

用水饱和正丁醇纯化粗皂甙溶液。

共萃取三次，待有明显分层时，弃去下层水相，收集并合并上层正丁醇部分，经旋转蒸发回收正丁醇，得到黄精皂甙的粗产品（徐丽萍，2007）。

1.2.4.2大孔树脂纯化

（1）大孔树脂的处理各大孔树脂分别用70%的乙醇浸泡。

将树脂分别一次性投入柱中。

用70%的乙醇从树脂底部缓缓的加入，进行反洗使小颗粒树脂冲出。

然后以2BV/h的流速正洗，洗至流出液加水不呈白色为止。

用去离子水以2BV/h的流速洗净乙醇，再用2BV4%的HCl溶液，以5BV/h的流速通过树脂层，并浸3h，再用去离子水以同样的流速洗至水洗液呈中性。

最后用2.5BV5%的NaOH溶液，以5BV/h的流速通过树脂层，浸泡3h，再用去离子水以同样的流速洗至水洗液呈中性。

（2）层析：

将黄精皂甙粗产品用乙醇稀释至浓度为0.8mg/ml加至已经准备好的大孔树脂柱（进行吸附，先用蒸馏水进行洗脱，洗脱至流出液不显molish反应（molish反应为鉴定单糖的反应，用蒸馏水进行洗脱的目的是为了先除掉粗产品中可能存在的糖类）为止，再用体积浓度为75%的乙醇进行洗脱，流速3.0ml/min，分步收集乙醇洗脱部分，8ml/管，每5管用香草醛-冰醋酸法跟踪检测皂甙含量，直至洗脱液无皂甙视为洗脱完全（洗脱液与树脂体积比约为4:

1），挥干乙醇，经冷冻干燥得到黄精皂甙成品，黄精皂甙的粗产品与大孔树脂的重量比约为1:

8。

1.2.4.3水饱和正丁醇萃取纯化后再过大孔树脂

将水饱和正丁醇萃取纯化后的皂甙再过XAD4大孔树脂进一步按1.2.4.2法纯化。

1.3皂甙含量测定

首先制作已知皂甙含量的标准曲线（蔡金星，2009；黄桂东等，2006）。

分别取0.1mg/ml的人参皂甙液0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0ml置于具塞试管内，挥干溶剂，在分别加体积分数为5%香草醛冰醋酸液0.2ml和高氯酸0.8ml，混匀、密塞，置于60℃恒温水浴锅中显色15min，取出后立即以冰水冷却5min，各加入冰醋酸5.0ml，摇匀，静置10min,以试剂空白为参比，用UV-722型分光光度计于波长544nm处测其吸光度。

回归方程为：

y=0.646X-0.1106，相关系数：

R2=0.9994。

待测皂甙样品作6个平行样，按照标准曲线制作的方法测其吸光度，根据标准曲线计算样品的皂甙含量。

1.4皂甙得率计算

皂甙得率的计算公式：

纯化的皂甙重量/黄精干粉重×100%

2结果与分析

2.1单因素对黄精皂甙提取率的影响

2.1.1不同料液比对黄精皂甙提取率影响

称取黄精粉末10g若干份，用75％乙醇分别配置成料液比为1:

5，1:

10，1:

15，1:

20，超声提取50min,，得到不同的料液比对皂甙提取率的影响，结果见图2。

可以看出，在一定范围内，皂甙提取率随料液比增加而上升，但在料液比为1:

15以后，提取率的增加趋于缓和，因此选择1:

10，1:

15，1:

20做正交实验。

图2不同料液对皂甙提取率影响

Fig.2Theeffectofdifferentratioofliquidtomaterialonextractionefficiencyofsaponins

2.1.2不同提取时间对黄精皂甙提取率的影响

取粉碎后黄精粉末10g若干份，用75％乙醇配成料液比1:

15，，提分别提取10min，30min，50min，70min得到不同提取时间对黄精皂甙提取率的影响，结果见图3。

从图中可以看出，随着时间的延长，皂甙的浸出量逐渐增多，但到70min后皂甙得率有下降的趋势，有可能是超声时间长，超声能产生温度过高引起皂甙降解，因此选择30min，50min，70min做正交实验。

图3不同提取时间对皂甙提取率的影响

Fig.3Theeffectofdifferentextractingtimeonextractionefficiencyofsaponins

2.1.3不同乙醇浓度对黄精皂甙提取率影响

取粉碎后黄精粉末10g若干份，配成料液比1:

15，提取50min，乙醇浓度分别为55%、65%、75%、85%，得到不同乙醇浓度对黄精皂甙提取率的影响，结果见图4。

从图中可以看出，随着乙醇浓度的提高，皂甙的浸出量逐渐增多，但到75%后增幅趋于缓和。

因此选55%、65%、75%做正交实验。

图4不同乙醇浓度对皂甙提取率的影响

Fig.4Theeffectofdifferentethanolconcentrationsonextractionefficiencyofsaponins

2.1.4不同提取次数对黄精皂甙提取率影响

取粉碎后黄精粉末10g若干份，用75%乙醇浓度配成料液比1:

15，提取50min，残渣根据相同的提取条件再进行提取，共提取3次，结果见图5。

从图中可以看出，随着提取次数的增加，皂甙的溶出量逐渐增多，但提取两次后增幅趋于缓和。

图5不同提取次数对皂甙提取率的影响

Fig.5Theeffectofextractingtimesonextractionefficiencyofsaponins

2.2正交实验方案及结果

2.2.1正交实验方案

据单因素实验结果，选出乙醇浓度、料液比、提取时间以及提取次数4个提取因素，每个因素3个水平（表1）的正交设计方案,按正交表进行正交实验，结果见表2。

表1正交试验L9（34）的因素和水平表

Table.1ThefactorsandleversoforthogonaldesignL9（34）

水平

因素

A乙醇浓度（%）

B提取次数

C提取时间（min）

D料液比

1

55

1

30

1:

10

2

65

2

50

1:

15

3

75

3

70

1:

20

2.2.2正交实验结果

表2正交试验的参数表

Table.2Theresultparameteroforthogonaldesign

实验号

A

B

C

D

得率（%）

1

1

1

1

1

3.49

2

1

2

2

2

4.56

3

1

3

3

3

4.51

4

2

1

2

3

6.17

5

2

2

3

1

4.32

6

2

3

1

2

5.34

7

3

1

3

2

4.42

8

3

2

2

3

6.74

9

3

3

1

1

5.71

K1

12.56

14.08

14.54

13.52

K2

15.83

15.62

17.47

14.32

K3

16.87

15.56

13.25

17.42

T1

4.19

4.69

4.85

4.51

T2

5.28

5.21

5.82

4.77

T3

5.62

5.19

4.42

5.81

R

1.43

0.52

1.4

1.04

注：

表中得率均为水饱和正丁醇纯化后得到的皂甙数据

表3正交实验方差分析结果

Table.3Varianceanalysisoforthogonalexperiment

方差来源

Variance

resource

偏差平方和

SS

自由度

f

均方

MS

F值

P值

A

10.117

2

5.058

7.394

*

B

1.522

2

0.761

0.730

C

9.352

2

4.676

6.531

*

D

8.487

2

4.243

5.642

*

注：

*表示显著差异，F0.05（2,6）=5.15

上述9个实验的结果，第8号实验（A3B2C2D3）皂甙提取量最高。

对比T值黄精皂甙提取的最佳工艺条件也是A3B2C2D3，即：

乙醇浓度为75%，提取两次，提取时间50min，料液比1:

20提取量最高；由R值可得对提取率影响因素大小依次为乙醇浓度>提取时间>料液比>提取次数（即A>C>D>B）。

因此提取皂甙最佳条件A3B2C2D3，从最佳提取条件可以看出超声提取产生的超声能可以很快的提高提取体系的温度，缩短提取时间。

2.3验证实验

在上述最优条件下，称取10g黄精粉末5份，进行重复性验证实验，结果平均皂甙得率为6.64%，相对标准偏差（RSD）为0.19%。

说明其稳定性较好，方法可靠。

2.4本法与传统的索氏提取法比较

分别采用传统索氏提取法和超声波提取法（本法）进行黄精皂甙的3次平行测定试验,并将测定结果进行统计分析比较。

结果表明,两种方法之间具有显著性差异。

本法如上所述平均皂甙得率为6.64%，相对标准偏差（RSD）为0.19%；而索氏提取法3次平均得率为4.24%，RSD0.22%，与本法比较具有显著性差异，t-检验p＜0.05,说明采用本法比传统提取方法得率高，，而且稳定性更好。

综合提取效率以及提取条件，如本法提取时间短、温度低、能耗少等，所以采用本法提取具有较强的优越性。

2.5纯度测定结果

图6不同纯化方式皂甙纯度

Fig.6Thesaponinscontentofdifferentclarificationmethods

1.XAD1180型大孔树脂2.水饱和正丁醇3.XAD4型大孔树脂

4.水饱和正丁醇+XAD4型大孔树脂

由图6看出，粗皂甙经XAD1180型纯化后，纯度为35.14%，经XAD4型大孔树脂纯化后，纯度为80.54%，水饱和正丁醇纯化后皂甙纯度为67.34%，水饱和正丁醇纯化后的皂甙再过XAD4大孔树脂柱，纯度达96.33%。

称取1g水饱和正丁醇纯化后的皂甙（纯度为67.34%），溶解后再过XAD4大孔树脂柱，实验平行5次，结果平均回收率达到93.91%（平均纯度达96.31%）。

由此可见，皂甙经水饱和正丁醇纯化后再过XAD4大孔树脂纯化的方法是一种稳定性好、回收率高、纯度高的优化方法，这为得到高纯度皂甙并进一步开发为药品等奠定了良好的基础。

根据表2中最佳提取条件时的粗皂甙得率6.74%以及水饱和正丁醇纯化后的皂甙纯度（67.34%）结合XAD4大孔树脂纯化后的回收率（93.91%）可以计算出从九华山多花黄精中提取的总皂甙含量可达4.17%，这与所报道的其他植物中的皂甙提取得率相比是较高的。

3讨论

在提取皂甙时作者采用乙醇试剂，因为乙醇对皂甙有较好的溶解能力，而其沸点低，无毒，能够回收，使乙醇可循环使用，节约成本。

因此本实验选择乙醇溶剂做为提取剂和洗脱剂。

在本实验中，根据皂甙不溶于乙醚，而脂类溶于乙醚的特点，采用乙醚萃取法脱去粗皂甙中的脂类，而且乙醚可以通过蒸馏回收，也防止了资源的浪费、节约成本。

提高皂甙提取的得率和纯度是本研究追求的目标，在本研究中通过提取条件的正交实验和统计分析筛选出一套具有稳定性较好的组合方式；在提取手段上采用超声（本法）与传统方法比较，得出本法得率更高，重复试验时稳定性好、耗时短、耗能低的一套工艺。

用于中草药成分分离纯化的大孔吸附树脂类型有:

D-101、DA-201型、MD-05271型、GDX-105型、CAD-40型、SIP系列、D-型等（马振山，1997）。

目前关于用大孔树脂纯化粗皂甙的实验已经很多，如顾维（2009）用D-101型大孔吸附树脂纯化薤白总皂甙取得了较好的效果，为该植物皂甙类成分的应用提供一可行性方案；关海宁选择AB-8、D101、NKA-2、NKA-9型大孔树脂纯化大豆皂甙，证实了AB-8型大孔树脂纯化效果较好（关海宁等，2010）；于杰用AB-8,D-101,D-100，D-141型大孔树脂纯化人参茎叶总皂甙发现D-101大孔树脂纯化效果较好（于杰，2009）。

而对于XAD系列的大孔树脂纯化皂甙的报道极少，本研究采用了XAD系列大孔树脂纯化黄精皂甙，其中的XAD4纯化效果明显优于XAD1180，特别是正丁醇纯化与XAD4纯化相结合效果尤为显著。

说明利用这一方法纯化皂甙的可行与优越性。

而且大孔树脂也可以回收，经过处理循环利用，也是节约成本的一种好方法。

作者在本实验的设计中，从提取皂甙选择有机溶剂（乙醇），到纯化皂甙所用的材料（乙醚，大孔树脂）等都是可以回收循环利用的。

这在工业大量的生产中具有很大的实际意义，可减少环境的污染以及节省相当可观的成本。

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