烟草染色体倍性快速鉴定方法概要.docx
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烟草染色体倍性快速鉴定方法概要
农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2006,14(2:
255~258
*基金项目:
国家自然科学基金(No.39870421,国家烟草专卖局项目(No.G1*******和浙江省重点科研项目(No.2003C22007资助。
作者简介:
朱惠琴女,1969年生,硕士。
**通讯作者。
Authorforcorrespondence.E-mail收稿日期:
2004-05-08接受日期:
2004-07-19
·研究论文
·烟草染色体倍性快速鉴定方法*
朱惠琴1,2
张宪银1,薛庆中1**
(1.浙江大学农业与生物技术学院,
杭州310029;2.青海大学农牧学院,西宁810003摘要:
对两个杂交组合(G28×NC2326和K326×Coker176F1烟草(
花药培养诱导出763个不同倍性
植株。
基于植株的花和种子结实率常规鉴定倍性水平比较,用气孔保卫细胞叶绿体数目预测植株倍性准确率达93.52%。
表明采用气孔保卫细胞叶绿体计数法可以在苗期快速、准确地确定植株染色体倍性。
同时,在移栽前间接地鉴定、筛选出叶绿体数<14的单倍体苗,作进一步秋水仙碱加倍处理,以减少对单倍体材料的浪费,加快DH群体构建速度。
关键词:
烟草;倍性;叶绿体;DH群体中图分类号:
S184
文献标识码:
A
文章编号:
1006-1304(200602-0255-04
RapidDeterminationofPloidyLevelofChromosomeinTobacco(
ZHUHui-qin1,2
ZHANGXian-yin1,XUEQing-zhong1**
(
Theploidylevelof763anthersdeirivedfrombothcrosses(G28×NC2326andK326×Coker176oftobbaco(weredetermined.Theresultofidentificationbycountingthenumberofstomachloroplastinguardcellwasconsistentwith
thoseobservationsofflowerandseedfertillityoftheplants,withtheaverageaccuraterateof93.52%,showingthatmeasurementofthenumberofstomachloroplastinguardcellcouldbeconsideredasafastandaccuratemethodtodeterminehaploid,diploidorpoly-ploidoftobaccointheseedlingstage.InordertoreducethewasteofhaploidplantsandspeedupestablishmentDHpopulation,itwasfeasibletoselectoutundoubtedhaploidplantswith<14chloroplastnumberinstomatreatedwithcolchicinewhenyoungplantletsjusttransplantedinthe
field.
tobacco;ploidylevel;chloroplast;DHpopulation.
从烟草花药培养诱导的植株几乎全部是单倍
体,通常需要对单倍体植株进行秋水仙碱处理,完成
染色体的人工加倍。
但如果加倍频率不理想时,
通过对处理植株的染色体倍性早期快速鉴定,对尚未加
倍的单倍体材料,继续加倍,
是构建DH群体十分重要的技术环节。
传统的倍性鉴定是基于对根尖细胞染色体计数,但是,普通烟草染色体数多(2、且小,经药物处理后中期的染色体长度也仅为2~4μm(Li,1991,制作细胞染色体制片需要相当熟练的实践技能,并且这种方法过程烦琐、费工费时。
虽然已有其它替代鉴定方法的报道(ChandlerandLyrene,1982;PowellSari1999,但未曾作
过大规模的筛选,其实用性尚待验证。
本实验根据构建烟草DH群体的需要,通过多种方法比较,重点探
讨气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定法应用价值,成功地构建了2个DH群体;完善了烟草染色体倍性早期快速鉴定的方法。
1材料和方法
1.1供试品种
在烟草(
现蕾期采集G28×NC2326和K326×Coker176两组合F1花蕾,取花药培养在H培养基上(BourginandNitisch,1967诱发单倍体试管苗,小植株用秋水仙碱添加二甲基亚砜(DMSO进行加倍处理获得加倍单倍体植株,随后种植并观察加倍单倍体植株性状。
农业生物技术学报2006年
图1.烟草不同倍性植株的保卫细胞及其叶绿体
Fig.1.Stomataguardcellsandtheirchloroplastatdifferentploidylevelsintobacco
A.单倍体;B.二倍体;C.多倍体.A.Haploid;B.Diploid;C.
Polyploid.
1.2倍性鉴定方法
对经过加倍处理的烟草,从第4片真叶完全出现开始,撕取样叶的下表皮于载玻片上并滴加10000mg/L的碘-碘化钾(1∶3染色,加盖玻片后,在40×的显微镜下计数保卫细胞内的叶绿体数;每叶片随机选取5个气孔,观察叶绿体数目并计算平均数。
在开花期观察不同倍性材料的开花及其结实情况并验证叶绿体鉴定结果。
对各组合的单倍体、二倍体及多倍体材料按1、4、7、10和13叶位的完全展开叶片分别取样,制片观测气孔叶绿体保卫细胞数目。
2结果和分析
2.1保卫细胞叶绿体数与染色体倍性的相关性
不同组合和倍性间气孔叶绿体数目平均值及方差分析(表1显示:
气孔保卫细胞叶绿体数目随倍性增加而增加,不同倍性烟草植株气孔保卫细胞叶绿
体数目的平均值差异极显著(<0.01,
而不同组合同一倍性间差异不显著(>0.05。
因此,烟草植株气孔保卫细胞叶绿体数目平均值可以作为染色体倍性水平的鉴定依据(图1。
烟草植株为异源四倍体,其染色体数为2n=4x=48,单倍体的染色体数n=24;烟草加倍单倍体气孔保卫细胞叶绿体数平均为21.28,单倍体为11.02,多倍体为32.25(表1,加倍单倍体和单倍体气孔保卫细胞叶绿体平均值之比为1.9∶1,通过χ2检验,符合二倍体和单倍体2∶1比例。
2.2利用保卫细胞叶绿体计数法鉴定倍染色体性
对763个花粉植株,显微镜统计第4叶气孔保卫细胞叶绿体数目,以预测染色体倍性结果(表2。
与常规花和育性差异鉴定倍性的方法比较,用气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定植株倍性的准确率达93.52%。
G28×NC2326和K326×Coker176组合的准
确率分别为95.45%和92.11%,说明该方法应用于烟草染色体鉴定非常有效。
表1烟草不同倍性植株气孔叶绿体数的比较Table1Comparisonsofstomataguardcellsandtheirchloroplastatdifferentploidylevelsintobacco
不同字母表示平均值在5%或1%水平差异显著。
DifferentlettersshowsignificantdifferencesbetweenmeanvaluesaccordingtoDuncansignificancetestat5%or1%level.
2.3不同叶位对保卫细胞叶绿体数的影响
对1、4、7、10和15叶不同叶位气孔保卫细胞叶
绿体的测定结果表明,除第1叶外,第4、7、10和15
叶气孔保卫细胞叶绿体数的平均数非常接近(表3。
由此可见,
取第4叶或以上叶片进行鉴定,其结果稳定可靠;以4叶以下作鉴定材料,倍性单株间差异显著,鉴定误判率达45%左右;同时,4叶以下的组织太幼嫩难于制片观察。
故本实验采用第4叶统计气孔保卫细胞叶绿体数目作鉴定,并据此构建DH群体。
2.4不同倍性植株气孔叶绿体数的分布
对单倍体,二倍体和多倍体植株气孔保卫细胞叶绿体数分布χ2检验,分别近似符合N(11.01,2.98,N(21.28,4.74,N(32.25,4.94的正态分布(图2。
其中,单倍体叶绿体数多分布在6~13,二倍体多分布在12~26,多倍体大多分布在21~38范围内。
因
此,将叶绿体数12、26和32确定为区分单倍体、
二倍体、多倍体的染色体倍性指标(表4。
虽然少量植
倍性水平组合Crosses
平均值PloidylevelsG28×NC2326
K326×Coker176
Average单倍体Haploid12.69.4311.02aA二倍体Diploid20.9621.621.28bB多倍体Polyploid
32.34
32.15
32.25cC
256
组合Crosses表2用保卫细胞叶绿体计数鉴定倍性水平的准确率
Table2Accuracyofdeterminationploidylevelsbythecountofchloroplastnumberofstomataguardcellsintobacco
表3烟草不同倍性植株不同叶位气孔保卫细胞叶绿体数
Table3Stomataguardcellchloroplastnumberofleafpositionatdifferentploidylevelsintobacco
表4烟草不同倍性植株气孔叶绿体数分布频率
Table4Destributionfrequenciesofstomatachloroplastnumberatdifferentploidylevelsintobacco
叶绿体计数鉴定
花和育性鉴定
Bycontingchloroplast
Byobservingflowerandfertility
单倍体二倍体多倍体单倍体二倍体多倍体HaploidDiploidPolyploidHaploidDiploidPolyploidG28×NC2326428206154581991475495.45K326×Coker17633524338272323512492.11Total
763
449
192
85
431
182
78
93.78准确率/%Accuracy
叶位保卫细胞数平均值变幅变异系数/%
LeafpositionsNo.ofguardcells
Average
Ranges
CV
单倍体Haploid
113347.894~1430.53484011.024~1617.32775011.564~1817.651073511.884~1817.3215724
12.01
6~19
18.00
二倍体Diploid
144018.9212~2728.46470221.2814~288.09712521.9612~268.781020521.8316~268.9615100
22.33
16~26
8.96
多倍体Polyploid
15628.3222~3626.6544532.2526~4211.5575032.7526~3811.34103233.0227~4311.9615
35
33.95
27~46
11.01
株各倍性间叶绿体数出现一定程度的重叠(图2,但
只要计数足够多,其准确率相当高。
本实验中每单株平均计数80个气孔。
倍性水平叶绿体数Chloroplastnumber
Ploidylevels<1212~1314~1516~1718~2021~2526~29>30单倍体Haploid68.9627.943.100000二倍体Diploid02.125.6715.655.9517.633.030多倍体Polyploid
4.79
12
83.21
3讨论
有关染色体倍性鉴定通常有直接和间接鉴定两
类方法。
采用根尖压片法对染色体直接计数,是最精
确和应用最早的方法(Li,1991,但这种方法要求具
有相当熟练的实验技能及一定的实验室设备。
某些作物的染色体数目多或本身很小给直接计数带来困难,通过形态学性状作间接鉴定则所需时间较长。
目
株数PlantNo.257
农业生物技术学报2006年
前借助流式细胞分析仪(FlowCytometry识别染色
体倍性,只需提取少量DNA,在苗期即可鉴定(DeLaat1987,但由于需要昂贵的仪器设备且较高费用,其应用的范围受到很大限制。
而测量气孔大小和保卫细胞叶绿体数目则简单、省力(ChandlerandLyrene,1982,但以气孔长度进行倍性分类的误
判率高(Ho1990。
在不同倍性植株间,
气孔大小特别是气孔长度的差异小于气孔保卫细胞叶绿体
数,以保卫细胞叶绿体数为基础的倍性鉴定,
也是一种快速、简便的鉴定方法(刘仁祥和黄莺,1998,但有重叠情况的发生(Powell1988,故其实用性尚待进行验证。
本研究较系统比较了单倍体,二倍体
及多倍体植株气孔保卫细胞叶绿体数及其变异,
通过大规模的验证表明,利用气孔保卫细胞叶绿体计数法间接鉴定,结果和田间结实情况的吻合率在93%以上;我们确认气孔保卫细胞叶绿体计数是判定烟草倍性水平的一种有效方法,处理一份材料仅需1~2min,而且对于未加倍成功的材料,可及早采取补救措施提高对材料的利用率,能够满足鉴定大量处理材料,筛选足够数量的加倍单倍体来构建
DH群体。
作者还提出在移栽前,
将叶绿体数<14的单倍体苗筛选出,继续加倍处理,
以减少对单倍体材料的浪费,加快DH群体构建速度。
参考文献
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(Thunb.MatsumandNakai(J.1999,82:
265~277
图2.烟草不同倍性植株气孔叶绿体数分布
Fig.2.Distributionofstomatachloroplastnumberatdifferent
ploidylevelplantsintobacco
258
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